蛋白质免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融部分的抗体检测。Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，「探针」是抗体，「显」用标记的二抗。经过 PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的二抗体起反应，经过底物显或放射自显影以检测电泳分离的特异目的基因表达的蛋白成分。一、操作步骤：1. 蛋白样品制备（1） 单层贴壁细胞总蛋白的提取：① 倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。② 每瓶细胞加 3ml 4℃ 预冷的 PBS（0.01 M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。③ 按1、提取时冰上操作，buffer 添加蛋白酶抑制剂；2、蛋白尽量同一批次提取、测定浓度，保存及使用情况尽量一致，防止部分样品有降解；3、蛋白提取后尽快测定浓度，添加标曲；4、好调整为统一浓度后上样体积保持一致；5、每孔上样体积不宜过大或过少，不超过大上样量，避免样品溢散污染；6、由于样品有一定粘滞，枪头吸液后外壁会黏附一些，加样时需注意，使用长而细的枪头；7、相比等体积上样，如果可以，尽可能使用 Photoshop（PS）处理 Western blot 条带及组图的过程：1. 打开 Western blot 图片，在 PS 中选择「文件」->「打开」并选择需要处理的 Western blot 图片文件；2. 调整图片大小和分辨率，可以使用「图像」->「图像大小」来调整 Western blot 图片的大小和分辨率，分辨率高于300 ppi；3. 调整图片对比度和亮度，使用① 选择「文件」->「打开」打开要计算灰度的 wb 结果图；② 使用「矩形选定工具」选定有条带的区域，然后选择「Edit」->「Selection」->「Make Band」来将选定区域定义为条带，框起其中一个结果，按 ctrl+1；（注：矩形框的长要小于宽的两倍）③ 把框移动到下一个结果，按 ctrl+2；④ 重复步骤 ③，一直到所有的结果都选上；⑤按 ctrl+3 进行计算；1、厚薄玻璃板须洁净，干燥，夹板架固定好玻璃板，注意不要漏液，设备保温施工注意两块玻璃板底部保持平齐；2、分离胶和积层胶溶液须充分混匀，加入 AP、TEMED 后迅速轻摇混匀，灌入两块玻璃板间隙中；3、用 1 mL 无水乙醇覆盖分离胶液面，阻断空气，分隔线会更加平直，待分离胶凝聚后倾斜架子，用滤纸吸干剩余的无水乙醇；4、梳子垂直插入两块玻璃板中间，注意避免梳子孔之间产生气泡，室温水平放置，待积层胶凝聚，轻轻1、蛋白降解；对策：于冰上提取，buffer 里加蛋白酶抑制剂防止降解。2、样品保存不当；对策：提取后尽快测定浓度，并煮沸变，未煮沸样品保存置于 -80 ℃ 保存。3、胶浓度较低，容易跑过头；对策：换用浓度较高的胶，例如 15% 或者用梯度胶。4、转膜时间太长，小分子蛋白转过头；对策：减少转膜时间，可尝试 200-250 mA 转 15-30 min 左右。5、膜孔径太大；对策：换用小孔径如 0原因：内参与待检测蛋白质的表达水平不同；内参和待检测蛋白的尺寸和分子量不同可能导致它们在电泳和转移过程中的运移速度不同；技术问题：在所使用的薄膜、抗体和染试剂等技术参数方面的差异会导致内参不均一。对策：选择特异高、表达量适中的内参蛋白；调整待测蛋白质的负载量；尽可能选择使用相同的技术参数，减少技术差异导致的内参不齐。（1）杂交信号很弱，条带浅，如下图原因及对策：1. 蛋白量太少，可以适当增加蛋白上样量；2. 抗体价太低，可以适当加大抗体浓度；3. 过度漂洗膜，也可能会导致信号变弱、条带太浅；4. 转移到膜上的蛋白太少，当蛋白分子量 <10 KD 时，可减少转膜时间、使用小孔径的膜或配置厚度适当的凝胶。（2）条带上有单个或多个白点原因及对策：「三明治」结构不紧凑导致，夹板做「三明治」结构时要确保膜和胶块近日，有网友在四川省网上群众工作平台留言询问称，“请问成贵高铁提速改造至时速350公里，什么时候正式开工建设？”对此，四川省发改委答复表示，“成贵高铁于2019年12月全线建成通车，设计时速250公里，其基础条件不满足按时速350公里运行的国家高铁相关规范。下一步，我们将持续动此项研究工作，并结车辆技术进步及运营经验积累，适时向国家层面进行汇报。”
联系人：何经理苏达尼还表示，伊拉克和叙利亚正开展协调作，共同应对端组织威胁。
